蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)是一种一年生的二倍体苜蓿，作为一种优良的牧草在全世界范围内被广泛种植。蒺藜苜蓿具有基因组小、生长期短、自花授粉、根瘤固氮、遗传转化效率高等特点，已成为豆科生物学以及逆境响应研究的模式植物(李紫薇等, 2014; 陈爱民等, 2006; 宋辉等, 2014; 姜格格等, 2013)。大豆与蒺藜苜蓿同属于豆科植物，在遗传上有较高的相似性，大豆基因组及转录组方面的研究可为蒺藜苜蓿、紫花苜蓿、豌豆、三叶草等豆科植物的研究提供更多的参考(刘志敏等, 2015)。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)是一种广泛存在于自然界中的代谢酶，分布在古菌，细菌，藻类和维管植物中。在高等植物中参与光合作用的碳固定、生物合成前体的供应、对pH的调控及豆科作物根瘤固氮过程信号级联反应(Xu et al., 2007)。有研究报道，在植物面对干旱(周宝元等, 2011; 方立锋, 2008)、强光(李霞等, 2005)、盐(Echevarría et al., 2001)、低磷胁迫(Wu et al., 2003)和冷害(Jane, 2011)等逆境情况下，PEPC蛋白的活性有所提高。由此表明，PEPC在植物非生物胁迫反应中也发挥一定的作用。然而，PEPC在碱胁迫反应中的作用尚无明确的报道。本研究以MtPEPC蛋白序列Medtr2g076670.2为目的基因，借助蒺藜苜蓿基因组数据库、大豆基因组数据库及公共数据库(NCBI, GEO, Phytozome)，对蒺藜苜蓿PEPC蛋白及与其同源的大豆PEPC蛋白Glyma.12G229400.1进行生物信息学分析，根据大豆PEPC蛋白的结构域、组织表达差异、碱胁迫表达谱及蛋白质相互作用预测蒺藜苜蓿PEPC蛋白在碱胁迫反应中的生物学功能，为蒺藜苜蓿该类基因的功能研究提供参考。

1结果与分析

1.1序列获取与功能域分析

以蒺藜苜蓿基因Medtr2g076670.2为种子序列，共获得具有相似保守结构域的苜蓿PEPC蛋白4个，大豆PEPC蛋白6个(表1)。苜蓿PEPC基因分别定位于第2、8、4号染色体上，大豆PEPC基因分别定位于第6、12、13号染色体上。

表1 蒺藜苜蓿和大豆PEPC蛋白的获取与定位

1.2结构功能域分析与同源序列比对

蒺藜苜蓿Medtr2g076670.2在161～966处为由806个氨基酸组成的PEPcase结构域(图1)；与之最相近的大豆蛋白为Glyma.12G229400.1 (GmPEPC1)，相似性为94.30%，也具有完整的PEPcase结构域，由此推测这两个基因可能具有相似的生物学功能。

图1 蒺藜苜蓿和大豆PEPC结构域

1.3蛋白质序列系统进化树分析

根据Medtr2g076670.2的氨基酸序列，在Phytozome数据库中检索6个豆科物种中其他的同源蛋白，经过筛选得到含有完整PEPC的结构域的氨基酸序列25个，利用MEGA5.0软件并采用NJ法构建系统进化树(图2)。25个PEPC蛋白一共被分成了3个分支，Group I分支中，蒺藜苜蓿蛋白Medtr2g076670.2、Medtr8g463920.2 (“■”所示)与大豆Glyma.12G229400.1 (“●”所示)相似性最高，Glyma.12G161300.1、Glyma.06G229900.1也属于此分支；在Group II中，Medtr2g092930.1与大豆中的Glyma.12G210600.1、Glyma.13G290700.1两个蛋白相似性最高，而Medtr4g079860.1则与大豆的Glyma.06G277500.1具有更高的相似性，并与四季豆的PEPC蛋白聚为一组；在GroupIII中，黄瓜、草莓和苹果中的几个蛋白聚为一组。此6个大豆PEPC基因在非生物胁迫反应中的作用均未见报道，并且均不是根瘤增强型的基因(Hata et al., 1998)。但值得注意的是，已经报道盐胁迫响应的野生大豆GsPEPC和GsPEPC1 (Qi et al, 2014)与大豆Glyma.12G161300.1、Glyma.06G229900.1具有98%~99%的相似性。由此暗示，PEPC蛋白在参与基本的生物代谢外，还通过其它的生物学过程响应非生物胁迫。

图2 Medtr2g076670.2基因系统进化树

1.4 PEPC蛋白二级结构分析

信号肽预测显示，蒺藜苜蓿和大豆PEPC蛋白都没有信号肽序列和跨膜区；均含有Ser/Thr和Tyr蛋白激酶磷酸化活性位点；并且蛋白主要由α–螺旋、不规则卷曲和延伸链组成。然而亚细胞定位预测发现，GroupI中与GroupII中的蛋白亚细胞定位信号存在差异，蒺藜苜蓿和大豆表现同样的特性。GroupI中蒺藜苜蓿和大豆PEPC蛋白主要定位于核、微体、叶绿体类囊体膜、叶绿体基质、线粒体(仅Medtr2g076670.2无线粒体定位信号)等几个组织，而GroupII中的5个蛋白却没有叶绿体类囊体基质的定位信号。亚细胞定位信号的差异暗示，同是PEPC类蛋白，在不同的组织部位和亚细胞结构中，参与不同的功能；并且，二级结构的差异决定了PEPC蛋白具有多种生物学功能(表2)。

表2 蒺藜苜蓿和大豆同源蛋白一、二级结构预测信息

1.5 PEPC蛋白组织特异性分析

由于蒺藜苜蓿数据库中没有基因表达谱数据，4个MtPEPCs基因序列及功能域与6个GmPEPCs基因具有较高的相似性，借助GmPEPCs基因组织特异性分析数据推测MtPEPCs基因的功能。根据进化树的分支，分别获得GroupI分支的3个PEPC蛋白(Glyma.12G229400.1, Glyma.12G161300.1, Glyma.06G229900.1)和GroupII分支的3个PEPC蛋白(Glyma.12G210600.1, Glyma.13G290700.1, Glyma.06G277500.1)根、根毛、叶片、根瘤、花等9个组织表达特性图谱(图3)。由此可见，GroupI分支的3个GmPEPCs基因在地下组织(根毛、根中及根瘤)中表达量高于叶片，茎等地上组织；相反GroupII分支的GmPEPCs基因主要在地上组织中表达。基因组织表达的特性与定位信号的分析、系统进化树分析具有类似的结果。PEPCs基因的生物学功能在地上部位和地下组织中存在不同的功能分工。

1.6蛋白质相互作用分析

同样借助大豆PEPCs蛋白的相互作用，辅助了解MtPEPCs蛋白的功能和调控机制。利用STRING交互式数据库搜索与Glyma.12G229400.1蛋白相互作用的蛋白，构建蛋白相互作网络(图4)。与GmPEPC1(Glyma.12G229400.1, Glyma.12G35840.1)互作的10个蛋白中(表3)，有5个是苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase, MDH)。MDH可以催化苹果酸与草酰乙酸间的可逆转换，主要参与TCA循环、光合作用、C4循环等代谢途径(汪新颖等, 2009)。其中Glyma.11G04720.1具有乙醛酸循环体活性，说明GmPEPC蛋白与乙醛酸循环代谢也存在关系。Glyma.20G02980.1、Glyma.07G35110.3这两个蛋白都有丙酮酸激酶活性，丙酮酸激酶参与糖酵解途径，是糖无氧酵解途径的三个关键调节点之一。丙酮酸激酶在第三阶段的最后一步中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转变为丙酮酸，产生能量ATP。在机体缺氧时糖酵解途径能迅速提供能量，为细胞的生命活动提供部分能量，其生成的一些中间产物是脂类和氨基酸等合成的前体(欧艳, 2010)。根据与GmPEPC1蛋白互作的蛋白类型可以看出PEPC参与TCA循环、光合作用、C4循环、乙醛酸循环、糖酵解等多种代谢途径。

图4 Glyma.12G229400.1蛋白与其他蛋白的相互作用网络

1.7碱胁迫基因表达分析

从NCBI的GEO中下载了NaHCO₃胁迫下大豆根(GSE17883)和叶(GSE20323)中的基因表达数据，分析了4个大豆PEPC基因及与之相互作用的9个蛋白在碱胁迫中的表达情况(图5)，推测MtPEPCs基因在碱胁迫下可能的生物学功能。在NaHCO₃胁迫下同一个基因在地上和地下组织中表达量及表达模式并不相同。Glyma.12G229400.1在根中的表达量明显高于在叶中的表达量，与之互作的蛋白Glyma17G10880.1在根中的表达量与在叶中的表达量也明显不同。除Glyma.12G229400.1基因外，Glyma06G277500.1在根和叶中的表达量都比较低，并且在碱胁迫下差异变化较少；Glyma12G161300.1在根和叶中的表达量均较低，为下调表达；Glyma12G210600.1在根和叶中的表达量均较高，但是在根中，该基因为上调表达，而在叶中则为下调表达。另外，根据基因表达聚类发现，在根和叶中，Glyma.10G34150.1和Glyma.08G06820.1基因表达模式与Glyma.12G229400.1相似，可确定该3个基因为“共表达”基因。该结果与相互作用网络构建的结果一致，说明GmPEPC1蛋白与该2个蛋白存在相互关系，Glyma.10G34150.1为未知蛋白，而Glyma.08G06820.1注释为苹果酸脱氢酶。由此推测，PEPC蛋白参与苹果酸脱氢酶的代谢途径，并通过该途径代谢的变化响应碱胁迫。

分别对大豆PEPC蛋白根和叶中的基因表达模式进行聚类分析(图6)，可以发现在叶中，3 h时基因的表达量达到了最大值，而在根中基因表达变化差异最大的时间点为6 h。但是也不难看出，根是最先响应碱胁迫的，胁迫1 h后，基因上调表达到最高值。

图5 大豆PEPC基因及其互作蛋白碱胁迫下根(a)和叶(b)中表达模式层次聚类

图6 大豆PEPC蛋白表达模式聚类分析 注: a:叶, b:根

2讨论

据报道，PEPC基因有不同的类型。在高等植物中PEPC有2个已知的功能形式，光合型的PEPC在C4光合作用和景天酸代谢(CAM)途径中催化大气CO₂初始固定形成C4二羧酸(Deng, et al., 2015)；非光型的PEPC已在C3植物的叶子和各种器官中发现，如：根发育中的种子和豆科植物根瘤中等。在根瘤中，PEPC发挥共生固氮的作用，在碳氮代谢中起到重要的作用(Naima et al., 1997; Nomura et al., 2006)。本研究发现与Glyma.12G229400.1相似的25个PEPC蛋白一共被分成了3个分支，其中Group I和Group II 2个分支中的PEPC蛋白在亚细胞定位信号存在着差异。除此之外，Group I的3个GmPEPCs基因在地下组织(根毛,根中及根瘤)中表达量高于叶片，茎等地上组织；而Group II分支的GmPEPCs基因主要在地上组织中表达。根据碱胁迫表达谱数据分析的结果，根最先响应碱胁迫，胁迫1 h后，基因上调表达达到最高值。综上所述，PEPCs基因对非生物胁迫的反应除了要考虑其不同类型外，还应考虑地上和地下2个不同的组织区域，地下部分首先感受胁迫信号，其势必与地上组织存在不同的功能分工。

Hata (1998)等发现，GmPEPC7基因与GmPEPC1/15及GmPEPC4基因在编码区具有98%~99%的相似性，但是3'-UTR的相似性仅有37%。而正是由于其非编码区的差异，导致GmPEPC7基因是根瘤增强型的PEPC，另两个基因则为持家基因。本文中所述的6个大豆PEPC基因均不是根瘤增强型的基因，但是不可忽视其非编码区及其启动子的差异。蒺藜苜蓿中4个PEPC基因在氨基酸序列上与大豆6个PEPC基因具有91%~98%的相似性，蒺藜苜蓿中PEPC基因是否具有与其相似的大豆PEPC基因的功能，还不能单纯从其序列的相似性推测，还需要考虑其非编码区和启动子顺式作用元件的差异。

根据pH稳态调节假说，高浓度HCO₃^–能激活PEPC，具有最佳活性，其结果是，产生苹果酸防止大量胞浆碱化。如果苹果酸的产生使胞浆过度酸化那么PEP的活性被抑制，而NADP-苹果酸酶(NADP-ME)被激活，增加苹果酸脱羧酶酶活以防止细胞质酸化(Sakano et al., 1998)。蛋白互作分析显示，与PEPC蛋白相互作用的9个蛋白中，有5个蛋白为苹果酸脱氢酶；另外，根据基因表达聚类发现，该2个基因为“共表达”基因，由此可以推定，PEPC可能是通过调控苹果酸脱氢酶的活性响应植物耐碱。另外，在根中，根瘤的发育也伴随着苹果酸的产生和分泌，这个过程的调控也与PEPC蛋白相关。

3材料与方法

3.1序列获取与定位

利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，搜索根据序列的相似性搜索蒺藜苜蓿MtPEPC (Medtr2g076670.2)的同源蛋白。在Phytozome(http://www.phytozome.net/)中搜索与Medtr2g076670.2蛋白具有相同结构域的大豆同源蛋白。

3.2结构功能域分析及同源基因系统进化树构建

运用在线分析工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行结构功能域分析，删除不含有完整PEPC保守结构域的蛋白序列，只保留存在完整PEPC保守结构域的并与Medtr2g076670.2具有80%以上相似性的蛋白。采用邻近相连算法(Neighbor-Joining)，利用MEGA5.0软件构建系统进化树。

3.4蒺藜苜蓿及大豆PEPC蛋白的二级结构预测

蛋白质序列信号肽及跨膜结构域预测分别采用CBS (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)服务器中蛋白预测工具signal peptide和TMHMM Serverv.2.0。亲疏水性分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)、磷酸化位点分析(http://www.expasy.eh/egi-bin/protscal.pl)及二级结构的预测(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)均利用在线工具进行分析。

3.6蛋白质相互作用分析

应用STRING交互式数据库(http://string-db.org/)搜索与Glyma.12G229400.1(Glyma.12G35840.1，PPC1)蛋白相互作用的其他蛋白质信息，搜索条件限制在10个蛋白内，构建的蛋白相互作网络。

3.7 PEPC基因及与其相互作用蛋白基因碱胁迫表达差异分析

在NCBI的GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE9730)数据库中下载大豆的根和叶在碱(NaHCO₃)胁迫下的表达谱数据，利用MeV4.9软件进行表达模式和层次聚类分析。

作者贡献

才华指导实验设计，进行论文写作与修改。任永晶是本研究实验工作的具体执行人，完成数据分析和论文初稿的写作。宋婷婷、姜柳和和许慧慧完成基因表达谱数据、进化树分析及数据整理、文章校稿工作。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家自然科学青年基金(31302022)和黑龙江省自然科学基金(C2015018)共同资助。感谢哈尔滨工程大学王洋和鲍佩华博士对本文序列分析方法的指导。

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